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  • 介紹轉(zhuǎn)染試劑的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法是如何操作的
  • 點(diǎn)擊次數(shù):3142 更新時(shí)間:2019-01-11
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  •   轉(zhuǎn)染試劑是一種非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,廣泛適用于轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞系,且細(xì)胞毒性非常低。由于使用該轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染時(shí)不要求去除血清或培養(yǎng)液,并且轉(zhuǎn)染后也不要求換液去除,因而使用起來非常方便。
     
      轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法:
     
      1. 接種細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度,將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿,每個(gè)孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到 70~80%。
     
      2. 準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物: DNA、EZ Trans 試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)下表所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋EZ Trans 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管,一邊將稀釋的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中(注意:請(qǐng)勿顛倒添加順序)。充分混勻后,室溫靜置 10~25 min 以形成DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時(shí),請(qǐng)用圓底聚丙烯管,例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。
     
      3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞:直接向每個(gè)孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時(shí),去除生長培養(yǎng)基,替換成無血清培養(yǎng)基,然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后,添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。
     
      4. 孵育細(xì)胞和分析結(jié)果:在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。請(qǐng)自行確定檢測時(shí)間。
     
      轉(zhuǎn)染試劑的使用注意事項(xiàng):
     
      轉(zhuǎn)染前須保證FuGENE® 6溫度已經(jīng)達(dá)到室溫,使用前須上下顛倒數(shù)次進(jìn)行簡單混勻。建議使用標(biāo)準(zhǔn)的24孔板作為FuGENE® 6轉(zhuǎn)染試劑的支架。請(qǐng)不要將原瓶中的FuGENE® 6進(jìn)行分裝。盡可能減少FuGENE® 6原液與塑料制品的表面接觸。不要使用硅化的槍頭或離心管。在稀釋FuGENE® 6時(shí),請(qǐng)務(wù)必保證將FuGENE® 6直接混入培養(yǎng)基,而不要接觸到離心管。
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