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技術(shù)文章首頁 > 技術(shù)文章 RNA抽提技巧(TRIZOL法)
  • RNA抽提技巧(TRIZOL法)
  • 點(diǎn)擊次數(shù):6853 更新時(shí)間:2016-08-18
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  •  為什么提取出的總RNA會(huì)降解?為什么OD260/280不在1.8-2.0之間?

    為什么。。。小伙伴們?nèi)绻羞@些疑問的話,不防往下看看到底是為什么。

    1、使用前防范:TRIzol劇毒且易揮發(fā)(由于主要成分是苯酚),lv仿呢也是一種有毒也易揮發(fā)的試劑,有的小盆友為了防止氧化,還會(huì)加入β巰基乙醇,這個(gè)反正建議有鼻子的童鞋都做好防護(hù)。提取RNA前做好保護(hù)措施,在通風(fēng)廚中操作,所有接觸TRIzol的耗材,扔到專門的密封的桶中,等待處理。否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)彌漫著氣味!

    2、*前奏:所有耗材(槍頭、EP管)均經(jīng)過RNA酶滅活或者直接購買無RNA酶的耗材,除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小時(shí)(DEPC雖然味道香,但卻是強(qiáng)致癌的,泡管子的時(shí)候別一直去聞它,一般來說煮沸或高溫高壓滅菌15min后,DEPC就會(huì)降解成二氧化碳和水),操作前戴口罩。

    3、RNA非常容易降解,所有步驟盡量在冰盒里面操作,包括離心時(shí)需用4度預(yù)冷的離心機(jī)。

    4、1-5×10^7細(xì)胞或者50-100mg組織加入1ml TRIzol,細(xì)胞或者組織過多,TRIzol過少會(huì)導(dǎo)致裂解不充分,內(nèi)源性RNA酶抑制不*,導(dǎo)致RNA降解。

    5、TRIzol加入細(xì)胞后,反復(fù)吹打,充分裂解細(xì)胞至均一透亮,不粘稠為止。

    6、加入Lv仿后充分混勻,其實(shí)這步也不能過于劇烈,上層的水相含有RNA,中間的組織相含有DNA和蛋白質(zhì),剩余的一部分DNA會(huì)萃取到lv仿中,同時(shí)lv仿具有使蛋白質(zhì)變性的作用,離心完,中間那層就是組織層。

    7、離心后,溶液分層,上層為含有RNA的水相,中間層乳白色的為含有部分DNA、蛋白質(zhì)的組織層,下層紅色的為含有DNA和部分蛋白質(zhì)的lv仿, 此時(shí),注意,“寧少勿多”,提取上層無色液體時(shí),小心輕柔,可以用200ul的槍抽吸,特別注意:一般1ml的TRIzol時(shí)zui多可以提取500μl上清,但是建議提取400ul以下,千萬避免吸到中間的乳白色組織層,否則zui后測量RNA時(shí),OD260/280非常低,會(huì)有蛋白混入。

     

    8、異丙醇加入的目的是為了使RNA沉淀,此時(shí)RNA已經(jīng)提出來了,應(yīng)輕輕混勻,避免RNA損傷。離心后肉眼可見EP管底部白色羽毛狀沉淀即為RNA沉淀。


    9、75%乙醇加入的目的是為了洗滌和沉淀作用,也應(yīng)該輕柔。

    10、zui后乙醇應(yīng)盡量充分揮干,先用槍頭盡量把75%乙醇吸干,再晾5min,否則沒有晾干乙醇,加入DEPC水時(shí)可能導(dǎo)致RNA白色沉淀不溶解。

    11、加入DEPC水溶解RNA時(shí),可根據(jù)自己需要的濃度來調(diào)整加入DEPC水的量。

    12、RNA提取后可以跑瓊脂糖膠來判斷降解情況,純的無降解的RNA跑完瓊脂糖膠后應(yīng)該有3條帶,26S,18S, 5S。其中5S很淡,不容易看見。如果條帶很淡,且有拖尾現(xiàn)象,提示有RNA降解。




     

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